美國(guó)加州大學(xué)圣地亞哥分校的研究人員指出，大約一半的已知致病基因變異是由SNVs引起的，堿基編輯通過(guò)引起臨時(shí)的RNA或DNA堿基改變，在許多遺傳疾病的治療中具有巨大的潛力。文中通過(guò)綜述DNA和RNA堿基編輯器及它們?cè)谔禺愋浴⑿省⒕_性和傳遞方面的研究進(jìn)展，并對(duì)新出現(xiàn)的治療機(jī)會(huì)和挑戰(zhàn)進(jìn)行了討論，助力精準(zhǔn)醫(yī)療領(lǐng)域的下一步發(fā)展。
 

　　隨著我們對(duì)基因組DNA的主要序列影響人類健康的理解擴(kuò)大，基因組編輯的治療潛力已經(jīng)出現(xiàn)。大約一半的已知致病基因變異是由單核苷酸變異(SNVs)引起的，這突出了開(kāi)發(fā)能夠高效糾正SNVs的方法和工具的必要性。堿基編輯是一種用來(lái)精確、高效地解決單核苷酸改變的技術(shù)，它避免了核酸主干的裂解，在基因組和轉(zhuǎn)錄組編輯過(guò)程中直接對(duì)靶堿基進(jìn)行化學(xué)修飾，Biolytic DNA合成儀包括DNA和RNA堿基編輯。Biolytic DNA合成儀單堿基編輯系統(tǒng)在實(shí)驗(yàn)中的應(yīng)用：
 

　　1.單堿基編輯系統(tǒng)在人類疾病治療方面的應(yīng)用
 

　　來(lái)自上海交通大學(xué)的常興組開(kāi)發(fā)了dCas9-AIDx堿基編輯系統(tǒng)，并將其應(yīng)用到腫瘤研究中。在腫瘤疾病治療過(guò)程中，基因上特定位點(diǎn)的堿基突變會(huì)使部分腫瘤細(xì)胞對(duì)抗腫瘤藥物產(chǎn)生耐藥性，如在慢性髓系白血病(chronicmy loidleukemia，CML)的治療中，常使用伊馬替尼藥物來(lái)抑制癌細(xì)胞中BCRABL激酶的活性，從而抑制白細(xì)胞的過(guò)度增殖。
 

　　但是，在治療過(guò)程中，癌細(xì)胞會(huì)在特定基因序列點(diǎn)突變(如常見(jiàn)的T315I突變)后產(chǎn)生耐藥性，這是目前腫瘤治療的一大障礙。針對(duì)這個(gè)問(wèn)題，常興組在CML患者來(lái)源的K562細(xì)胞系中表達(dá)了dCas9-hAIDx的融合蛋白，由于沒(méi)有使用UGI，因此AIDx修飾的胞嘧啶C及互補(bǔ)的鳥(niǎo)嘌呤A可以隨機(jī)地向其它三種堿基轉(zhuǎn)變。他們使用sgRNA文庫(kù)將dCas9-AIDx靶向到ABL基因的第6個(gè)外顯子，誘導(dǎo)點(diǎn)突變的發(fā)生。通過(guò)用伊馬替尼藥物篩選，將伊馬替尼耐藥的細(xì)胞與篩選前細(xì)胞的ABL的第6個(gè)外顯子進(jìn)行深度測(cè)序分析，發(fā)現(xiàn)了10個(gè)與伊馬替尼耐藥相關(guān)的基因突變位點(diǎn)，包括了在臨床中已被證實(shí)的T315I突變。該研究證明，可以利用此系統(tǒng)篩選腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生耐藥性的突變，探究腫瘤疾病的耐藥機(jī)制，開(kāi)創(chuàng)了篩選腫瘤耐藥突變的新方法，結(jié)合第二代測(cè)序技術(shù)在臨床中的應(yīng)用，將有助于癌癥病人耐藥的早期發(fā)現(xiàn)，提高癌癥病人的生存率。
 

　　2.單堿基編輯系統(tǒng)在動(dòng)物模型方面的應(yīng)用
 

　　目前，大多數(shù)關(guān)于單堿基編輯系統(tǒng)的研究報(bào)告主要基于細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，而其在動(dòng)物模型開(kāi)發(fā)中的應(yīng)用將有利于研究人員深入研究疾病發(fā)生和發(fā)展的機(jī)理。韓國(guó)首爾大學(xué)Jin-SooKim組發(fā)表了將rAPOBEC-XTEN-Cas9n-UGI(BE3)系統(tǒng)運(yùn)用于小鼠疾病模型制備的研究成果。針對(duì)小鼠的抗肌萎suo蛋白基因Dmd以及酪氨酸酶基因Tyr，分別設(shè)計(jì)了特異識(shí)別的sgRNA，顯微注射sgRNA和rAPOBEC1-XTEN-Cas9n-UGI融合蛋白的mRNA或者電轉(zhuǎn)染sgRNA和rAPOBEC1-Cas9n-UGI蛋白的復(fù)合物到小鼠受精卵。
 

　　在所獲得的9只Dmd的F0代小鼠中，有5只小鼠產(chǎn)生了靶位點(diǎn)的堿基突變，包括一只純合子突變小鼠(CAG>TAG)。進(jìn)一步通過(guò)免疫染色發(fā)現(xiàn)，在這只純合子Dmd突變小鼠體內(nèi)幾乎檢測(cè)不到該蛋白的表達(dá)。而通過(guò)電轉(zhuǎn)染gRNA和rAPOBEC-XTEN-Cas9n-UGI融合蛋白的復(fù)合物，產(chǎn)生了7只TyrF0后代小鼠中均檢測(cè)到靶基因突變，包括3只純合子Tyr突變小鼠。
 

　　與Jin-SooKim的發(fā)現(xiàn)類似，也發(fā)現(xiàn)了堿基編輯系統(tǒng)會(huì)在胚胎中產(chǎn)生堿基的缺失，并報(bào)道了在小鼠胚胎中由堿基編輯系統(tǒng)誘導(dǎo)產(chǎn)生的靶位點(diǎn)處的堿基插入以及臨近位點(diǎn)的脫氨基。由于所用的dCas9-HF2不具有核酸酶活性，他們認(rèn)為，堿基的插入和缺失是由于胞嘧啶脫氨基后產(chǎn)生的U被堿基切除修復(fù)機(jī)制識(shí)別，并被切除從而產(chǎn)生無(wú)堿基位點(diǎn)，無(wú)堿基位點(diǎn)再進(jìn)一步轉(zhuǎn)化成DNA雙鏈損傷，從而導(dǎo)致堿基插入和缺失的產(chǎn)生。以上兩項(xiàng)研究結(jié)果充分證明了單堿基編輯系統(tǒng)能高效地用于制備疾病動(dòng)物模型，但仍需進(jìn)一步優(yōu)化來(lái)提高特異性及降低堿基插入和缺失的產(chǎn)生。
 

　　3.單堿基編輯系統(tǒng)在植物方面的應(yīng)用
 

　　轉(zhuǎn)基因技術(shù)在改良作物性狀方面已經(jīng)做了大量的工作，但由于外源基因的導(dǎo)入和公眾科普的缺乏，使得轉(zhuǎn)基因作物的推廣和應(yīng)用存在較大難度。作物在漫長(zhǎng)的人工選育過(guò)程中，人類通過(guò)人工選擇的方式定向選育具有優(yōu)良性狀的基因突變株，但該過(guò)程耗時(shí)耗力且不可控。利用同源重組技術(shù)，可以獲得定點(diǎn)修飾的優(yōu)良植物株，但由于同源重組的效率太低，因此可行性不高。單堿基編輯技術(shù)在人細(xì)胞中高效編輯單個(gè)堿基的結(jié)果提示，以通過(guò)該系統(tǒng)在農(nóng)作物中的進(jìn)行定點(diǎn)可控的基因編輯，進(jìn)而快速、高效地獲得優(yōu)良性狀的植株。
 

　　研究還發(fā)現(xiàn)在作物中胞嘧啶核苷脫氨酶的作用活性窗口為7個(gè)核苷酸序列，從距離PAM最遠(yuǎn)端數(shù)起的第3～9位核苷酸，這相對(duì)于在動(dòng)物細(xì)胞中的編輯窗口更廣。嘗試采用土壤桿菌為載體，攜帶Cas9n-XTEN-rAPOBEC1-UGI融合蛋白和sgRNA，編輯水稻內(nèi)一種衰老控制基因OsCDC48。研究結(jié)果顯示，單堿基編輯效率在5.0%～32.5%，靶位點(diǎn)處沒(méi)有發(fā)現(xiàn)核苷酸序列的隨機(jī)插入或缺失，而且預(yù)測(cè)可能的脫靶位點(diǎn)處也沒(méi)有發(fā)現(xiàn)突變。同一時(shí)間，中科院上海生命科學(xué)研究院的朱健康團(tuán)隊(duì)和中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所的夏蘭琴團(tuán)隊(duì)也分別報(bào)道了運(yùn)用單堿基編輯系統(tǒng)對(duì)水稻基因進(jìn)行單堿編輯。這三個(gè)獨(dú)立的研究表明，單堿基編輯系統(tǒng)可以在農(nóng)作物中取得高效的編輯效率，為改良作物品種帶來(lái)新希望。